WAT IS PCR? HOE WERKT PCR? HOE WERKT PCR? Extractie van DNA: Voordat PCR kan worden gestart, moet de DNA- of mRNA-streng beschikbaar worden ge- maakt en geïsoleerd. Deze procedure is afhankelijk van het type monsterma- teriaal. Het geëxtraheerde DNA en de primers worden gemengd met nucleotiden en DNA-polymerase. DNA-polymerasen is een enzym dat de nucleotiden samen- stelt door DNA te kopiëren. Nu kunnen de 3 stappen van de PCR-reactie worden gestart: 1. Denaturatie: de PCR-machine ver- warmt het monster boven 90 °C, waarbij een denaturatie optreedt die ervoor zorgt dat de DNA-streng zich splitst in twee enkele strengen. 2. Hybridisatie (Annealing): de machine koelt het monster weer af en de primers binden aan hun eigen doel- sequentie op de DNA-streng. 3. Elongatie (Extention): de tempera- tuur wordt weer verhoogd, waardoor de DNA-polymerase efficiënt werkt om nucleotiden toe te voegen aan de verlenging van de primer en de DNA-streng wordt gekopieerd. 10 / eurofysica.nl De doelsequentie die je wilt versterken (amplificeren), is geselecteerd. Twee primers, gericht op deze sequentie van respectievelijk de 3' en 5' uiteinden van de DNA-streng, worden geselecteerd. Deze primers zijn chemisch gesynthe- tiseerd en bevatten meestal tussen de 20 en 45 basenparen. (Als mRNA wordt geanalyseerd in plaats van DNA, wordt eerst een complemen- taire kopie van de mRNA-sequentie gemaakt, zodat een sequentie wordt verkregen die lijkt op de dubbelstrengige DNA-sequentie) Een reageerbuis met het bovenstaand mengsel wordt in een PCR-machine geplaatst. De PCR-machine is een eenvoudige machine die een plaat met houder voor reageerbuizen bevat en de enige functie heeft om het monster snel te verwarmen en af te koelen in voorgeprogrammeerde cycli. De PCR-reactie wordt gedurende een bepaald aantal cycli herhaald en de DNA- of mRNA-streng van het monster- materiaal wordt geamplificeerd. Hoe va- ker de cyclus wordt herhaald, hoe meer DNA-kopieën worden geproduceerd. Scheiding van DNA-fragmenten vindt meestal plaats door gel-elektroforese. Hier wordt de geamplificeerde kopie van de DNA- of mRNA-streng geïsoleerd als een band in een gel, die vervolgens met een lichtplaat (transilluminator) gekleurd en zichtbaar gemaakt kan worden.
Download PDF fil